热休克蛋白47-shRNA调节肝星状细胞膜受体对日本血吸虫鼠肝纤维化的影响

摘要：目的 了解热休克蛋白47-短发夹RNA (HSP47-shRNA)调节肝星状细胞(HSCs)膜受体对日本血吸虫鼠肝纤维化的影响. 方法 建立日本血吸虫鼠肝纤维化模型,感染前(健康对照组)和感染后第4、9、14周,分别随机取5只小鼠,提取肝脏组织总RNA,采用RT-PCR检测HSP47 mRNA相对表达水平,蛋白质印迹(Western blotting)检测HSP47蛋白表达情况,用RM-6240BD型多道生理信号系统动态检测模型鼠门静脉压力,流式细胞术检测HSCs膜内皮素受体(ETAR和ETBR)的平均荧光强度(MFI),免疫组织化学法检测感染前和感染后14周的模型鼠肝组织膜受体表达情况,采用线性相关分析方法分析各时间点的HSP47 mRNA相对表达水平与门静脉压力、ETAR和ETBR相对表达量的关系.用HSP47-shRNA质粒转染小鼠成纤维细胞NIH/3T3细胞和血吸虫肝纤维化模型鼠,并设阴性对照组(空质粒)和空白对照组(PBS),每组12只血吸虫感染模型鼠.采用RT-PCR检测NIH/3T3细胞转染0、24、48 h及模型鼠干预至第14周的HSP47 mRNA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA相对表达水平,Western blotting检测对应蛋白的表达情况,流式细胞术检测膜受体(ET、TGF-β及PDGF的受体)的MFI.两组间均数的比较采用Student-t检验,多组间采用单因素方差分析. 结果 模型鼠感染日本血吸虫后第4、9、14周,RT-PCR结果显示,HSP47 mRNA相对表达水平分别为0.592±1.031、1.253±2.101和0.651±1.532,较感染前(0.253±0.120)均升高(P＜ 0.01);Western blotting结果显示,HSP47蛋白表达情况与mRNA变化一致;门静脉压力分别为(3.010±0.250)、(8.850±0.63)和(12.390±0.830) mm Hg,感染后第14周与感染前的(2.350±0.180) mm Hg比较,差异有统计学意义(P＜0.01).流式细胞术检测结果显示,ETAR的MFI分别为3245±186、6 108±213和8 784±257,高于感染前的2 104±232(P＜ 0.01);ETBR的MFI分别为3 812±158、4524±197和5554±156,高于感染前的2091±237 (P＜ 0.01).相关性分析结果显示,HSP47 mRNA相对表达水平与门静脉压力、ETAR和ETBR的MFI均呈正相关(r=0.750、0.750、0.508,P＜ 0.05).免疫组织化学结果显示,感染后第14周,ETB、TGF-β和PDGF的受体在肝纤维聚集部位呈强阳性表达.HSP47-shRNA转染NIH/3T3细胞48 h后,RT-PCR结果显示,转染组HSP47 mRNA相对表达水平为0.254±2.358,低于阴性对照组的0.911±1.391 (P＜ 0.01);Western blotting结果显示,HSP47蛋白表达情况与mRNA变化一致;Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA相对表达水平分别为0.656±0.061、1.330±0.155,较阴性对照组的1.521±0.314、2.243±0.142均下调(P＜0.01);流式细胞术检测结果显示,ETBR的MFI为53.433±5.243,高于转染前的30.825±5.460(P＜0.05),TGF-β及PDGF受体转染前后差异无统计学意义(P＞ 0.05).转染组小鼠体内干预至第14周后,RT-PCR结果显示,HSP47 mRNA相对表达水平为2.686±0.711,低于阴性对照组的6.001±0.458 (P＜0.01);Westernblotting结果显示,HSP47蛋白表达情况与mRNA变化一致;Ⅰ型、Ⅲ型前胶原mRNA相对表达水平分别为10.956±2.079和14.071±1.915,均较空白对照组的22.687±1.478和29.065±2.537下降(P＜0.01);流式细胞术检测结果显示,转染组ETAR表达阳性率为(51.48±4.27)％,低于空白对照组的(81.60±6.07)％(P＜0.05);转染组小鼠HSC膜受体ETAR、ETBR的MFI分别为4249±344和3706±194,均低于空白对照组的8538±494和5052±213 (P＜0.05),TGF-β和PDGF受体转染前后差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 HSP47-shRNA可干预活化的HSC和血吸虫肝纤维化鼠,ETR变化为影响肝纤维化尤其门静脉高压的因素.